基因编辑界的明星——CRISPR/Cas9系统

岳永莉 李雪玲

        要说当今基因编辑界最红的明星是谁？那非CRISPR-Cas技术莫属了，自从2013年哈佛大学与麻省理工学旗下博德研究所的张锋团队在《科学》杂志上发表了在哺乳动物细胞中应用CRISPR-Cas9技术的论文，全世界的生物学家都要疯狂了。为什么呢？因为过去的基因编辑工具费时费力还特别烧钱，例如第一代基因编辑工具锌指核酸酶ZFN和第二代转录激活子样效应因子核酸酶TALEN，他们的工作原理都依赖于蛋白对DNA位点的识别，生物公司一般的价格要上万美元，一般的实验室根本无法承受。而CRISPR-Cas9技术将基因编辑变得so easy，它对位点的识别是依赖一段向导RNA分子（sgRNA），因此一个带有Cas9和能识别靶位点的sgRNA的质粒就可以搞定了，成本也就几千元，基因编辑的效率却提高了一个数量级。有学者认为CRISPR-Cas技术是可以比拟上世纪PCR技术的开拓性基因工程技术。下面笔者就来揭示一下这个CRISPR-Cas系统的前世今生。

一、CRISPR/Cas系统的结构

        CRISPR/Cas系统相当于是细菌和古细菌的免疫系统，当遇到外来物入侵如病毒时，可将外来入侵者的遗传信息即DNA序列记录在细菌自己的基因组中，等再遇到入侵者时，CRISPR/Cas系统就可以识别它，将入侵者DNA精准的切断，实现防御打击入侵者的目标。

        CRISPR/Cas系统由两部分构成，即CRISPR序列和Cas蛋白，在长期的进化过程中，Cas蛋白与CRISPR序列共同进化，预算形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。

    1. CRISPR简单来说就是一段重复序列，它的全称是Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats——成簇的规律间隔的短回文重复序列，这个序列在细菌中的分布比较广泛，在40%的已测序的细菌基因组中存在。

CRISPR序列由两类序列组成：间隔区（spacer）和重复序列区（repeats）。间隔区就是被细菌俘获的外来物DNA序列，每经历一次入侵留下一段序列，最终积累了多个间隔区序列，长度在20-72bp。重复序列区是一段短重复序列，序列一致，长度在21-47bp，将不同的间隔区分离开，由于含有特殊的回文序列，这段序列可以形成发卡样的结构。在重复序列区和间隔区的上游有一个前导区（leader），是CRISPR序列的启动子，负责启动它身后的序列转录，转录出来的单链RNA被命名为CRISPR RNAs(crRNAs)。

    2. Cas（CRISPR associated）蛋白，位于CRISPR序列的上游，是一个蛋白家族。不同的CRISPR/Cas系统需要多个Cas蛋白形成复合体才能切断DNA，只有Cas9可以独立切断DNA，目前应用最成功最广泛的也是Cas9。Cas9蛋白有1个识别结构域REC和2个核酸酶结构域HNH和RuvC，位于蛋白中间位置的HNH核酸酶，负责切割与crRNA配对的单链DNA,位于氨基端的RuvC核酸酶负责切割与crRNA序列相同的那条DNA单链（非配对链），二者联合可将DNA双断形成一个平端切口。

二、CRISPR/Cas9系统的工作原理

    CRISPR/Cas9系统精准打击外来入侵者分三步走：

    1. 俘获外源DNA：

这一步相当于给外来入侵者“备案”，将其身份信息备注在记忆库里，以备将来遇到的时候消灭它。当病毒首次入侵细菌，注入自身的双链DNA，CRISPR/Cas系统会从中截取一段序列整合到细菌自己基因组的CRISPR序列之中作为新的间隔序列，相应的把病毒上的这段序列称为原间隔序列（protospacer），相当于细菌给病毒备注的身份信息。细菌选定的病毒原间隔序列一端序列较为保守，被称为PAM（protospacer adjacent motif，原间隔序列临近基序），通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。

病毒入侵时，Cas1和Cas2编码的蛋白识别出PAM区，将PAM区临近的DNA序列作为候选，随后Cas1/2蛋白复合物将这段候选序列剪切下来，在其他酶的作用下插入到细菌基因组的CRISPR序列前导区的下游。这样的话，病毒的身份信息就以CRISPR间隔序列的形式保存到了细菌基因组中。

    2. crRNA合成：

当入侵者到来，前导区指导转录出两种RNA： pre-crRNA (pre-CRISPR-derived RNA)和tracrRNA（trans-acting crRNA），前者是涵盖了整个CRISPR序列的大型RNA分子，后者是由重复序列区构成有着发卡结构的RNA。然后，pre-crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白进行组装。根据入侵者的序列信息，经RNase Ⅲ作用将pre-crRNA进行剪切，去除无关的间隔序列，形成成熟的crRNA（仅保留入侵者原间隔序列RNA以及部分重复序列区），如此就形成了crRNA/tracrRNA/Cas9终极复合物。

    3. 消灭入侵者：Cas9/tracrRNA/crRNA复合物识别出入侵者的原间隔序列（与crRNA互补），定位到“PAM-原间隔序列”区域，将DNA双链解螺旋成两条单链，crRNA与其中一条DNA链结合后，Cas9蛋白的HNH酶活性可切断这条DNA链，同时Cas9蛋白RuvC活性位点会将另一条DNA链也切断，造成入侵者DNA双链断裂（DSB），入侵者就game over了。

三、CRISPR/Cas9系统应用策略

细菌的CRISPR/Cas9系统需要pre-crRNA和tracrRNA这两条RNA链的参与，经过试验证明，将这两条链融合成一条RNA（Single guide RNA, sgRNA），也可以指导Cas9识别切割。选择特定位点设计合成sgRNA，联合Cas9一起导入细胞中，即可造成指定位点的DNA双链断裂，若同时引入多个sgRNA即可引起多个位点的断裂。

    细胞内自身存在应对DSB的修复机制，如果有DNA模板则根据模板进行精确修复，如果没有模板时修复的同时可能就会引入随机的缺失或插入而造成基因突变。

    1.一个或多个sgRNA和Cas9的引入，造成单位点或多位点的断裂，引起单基因或多基因的突变/缺失/插入，进而研究基因功能。利用该系统开发的高通量筛选技术，可快速鉴定与表型相关的特定基因以及非编码RNA等。

    2. 设计合成DNA修复时的模板，即将一段目的片段两端连上选定断裂位点两端的同源序列，在sgRNA和Cas9的作用下，可于DNA修复过程中在DSB处插入目的片段，通过筛选获得转基因细胞，研究目的片段对细胞的影响。

    3.改造Cas9的蛋白序列使Cas9失去核酸酶切割活性，仅保留其识别位点功能，改造后称为dead Cas9（dCas9）。在dCas9上连接转录抑制子或转录激活子，实现调控基因表达的目的。也可在dCas9上连接DNA修饰酶（DNA甲基转移酶、去甲基化酶等）或组蛋白修饰酶（组蛋白甲基转移酶、乙酰化酶等），对靶基因进行表观遗传修饰等。

四、CRISPR/Cas9系统的应用实例

    1. 改良家畜性状

家畜生产性状改良依靠传统育种方法费时费力，CRISPR/Cas9系统的应用经济又高效，可将性状改良过程大大提速。

    2016年西北农林科技大学的陈玉林等在PLoS One杂志上发表文章，检测了他们所获得的6只FGF5基因打靶绒山羊皮肤的羊毛与羊绒生长情况，发现FGF5基因中部分碱基的缺失，使得羊毛长度增加，次级毛囊数量和羊绒纤维长度也同时增加，导致出生后120天时的羊绒产量平均增加了92.75克，比对照组平均值提高了大约30%左右。

    2017年新疆大学刘明军课题组在FEBS Journal杂志上发表文章，他们通过对FGF5基因进行基因打靶，提高了绵羊的羊毛纤维长度与拉伸长度，进而提高了羊毛产量。他们设计了    在中国美丽奴绵羊体外受精的一细胞注射CRISPR/Cas9系统的实验，最终获得16只FGF5基因打靶羔羊，其中有12只存活了1年以上，FGF5基因发生了碱基插入或碱基缺失，造成FGF5蛋白功能的缺失，羊毛的平均产量比对照组提高了约26%左右。此外，他们检测了软件所预测的脱靶位点，结果显示未发生一例脱靶现象。

    2017年西北农林科技大学的张涌教授在Genome Biology杂志上发表文章，称他们通过CRISPR/Cas9系统获得了转NRAMP1基因的转基因奶牛。实验利用了特殊的Cas9n（single Cas9 nickase），在DNA双链上制造出单链缺口（SSB），获得牛转基因成纤维细胞系，再通过核移植操作，最终获得9头转基因牛，他们均具有抗结核病的能力。他们认为Cas9n的应用大大降低了脱靶效应。

        2. 治疗白血病和艾滋病

     2019年9月北京大学邓宏魁研究组在The England Journal of Medicine杂志上发表了一篇利用CRISPR/Cas9治疗同时患有白血病和艾滋病病人的文章。该研究组经过对细胞处理方法及Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合体等一系列优化，将骨髓捐献者的CD34+造血干细胞中CCR5基因（HIV病毒入侵T细胞的主要共受体）进行基因编辑敲除后，移植到同时患有白血病和艾滋病的年轻患者体内，在之后的19个月时间里，病人的白血病病情得到持续缓解，骨髓细胞中能够持续检测到CCR5基因编辑细胞，实现了经基因编辑后的成体造血干细胞在人体造血系统内的长期稳定重建，并且未检测到脱靶现象及其他副作用。这是世界首次利用基因编辑治疗艾滋病和白血病的临床研究，为未来将CRISPR/Cas9系统应用于血液系统疾病精准医疗打开了良好开端。

结语

    CRISPR/Cas9系统作为基因编辑界万众瞩目的明星，虽然存在脱靶的危险，转入细胞的方式可能存在潜在风险，它的商业应用涉及国际专利之争，但是科学家们正在致力于改善CRISPR/Cas9系统，降低它的风险，中国也在开发更安全的CRISPR/Cas系统，试图通过自主创新拥有属于自己的专利。总之，CRISPR/Cas9系统的发明使精准基因编辑不再是梦想，一些由于基因突变引起的疾病有了治愈的可能，可以说CRISPR/Cas9系统为整个生物界带来了一场颠覆性的革命。

参考文献

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